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熒光定量PCR儀的理論模式講述

更新時(shí)間:2017-07-28瀏覽:2037次
  熒光定量PCR儀以參照物為標(biāo)準(zhǔn),對(duì)PCR終產(chǎn)物進(jìn)行分析或?qū)CR過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè),從而達(dá)到評(píng)估樣本中靶基因的拷貝數(shù),稱(chēng)為定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期進(jìn)行的。
  PCR是對(duì)原始待測(cè)模板核酸的一個(gè)擴(kuò)增過(guò)程,任何干擾PCR指數(shù)擴(kuò)增的因素都會(huì)影響擴(kuò)增產(chǎn)物的量,使得PCR擴(kuò)增終產(chǎn)物的數(shù)量與原始模板數(shù)量之間沒(méi)有一個(gè)固定的比例關(guān)系,通過(guò)檢測(cè)擴(kuò)增終產(chǎn)物很難對(duì)原始模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量。近年來(lái)研究人員通過(guò)大量的實(shí)踐,研究了相對(duì)準(zhǔn)確的定量PCR方法,即熒光定量PCR儀的熒光定量PCR。
  PCR擴(kuò)增通式:
  1.Tn=T0(1+E)n;
  2.Tn=Tn-1(1+E)n。
  注:其中E表示擴(kuò)增效率,n為循環(huán)數(shù),Tn表示在n個(gè)周期后PCR產(chǎn)物的數(shù)量,Tn-1表示在n-1個(gè)周期后PCR產(chǎn)物的數(shù)量,T0為原始模板數(shù)量。設(shè)定PCR到達(dá)指數(shù)擴(kuò)增期時(shí),產(chǎn)生一定的熒光高于背景為儀器所識(shí)別,此時(shí)的循環(huán)數(shù)為CP,也就是K=T0(1+E)CP,取對(duì)數(shù)即:
  lg K=lg T0+CP*lg(1+E);
  CP=-1/lg(1+E)*lg T0+lgk/lg(1+E)。
  由于對(duì)一特定的PCR而言,E與K均為常數(shù),故上式為循環(huán)數(shù)(CP)對(duì)原始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)(lg T0)一次方程,其標(biāo)準(zhǔn)形式y(tǒng)=kx+b,該直線的斜率為-1/lg(1+E),在橫坐標(biāo)上的截距為lgk/lg(1+E),也是熒光定量PCR儀所謂的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
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