本來(lái)，
定量PCR儀是為了將樣本中微量的DNA模版放大以便研究模版特性，隨著研究的深入，要了解樣本中基因的表達(dá)模式與疾病的關(guān)系，就需要了解標(biāo)本中的DNA原始拷貝數(shù)。理論上定量PCR儀試驗(yàn)過(guò)程中反應(yīng)產(chǎn)物是以指數(shù)規(guī)模增長(zhǎng)的，但實(shí)際的PCR擴(kuò)增曲線并不是標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線，而是S形曲線——因?yàn)殡S著PCR循環(huán)數(shù)的增加，擴(kuò)增規(guī)模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各種PCR要素逐漸不敷需求，PCR的效率降低，產(chǎn)物生成的速度逐漸減緩，終進(jìn)入平臺(tái)期。由于各種環(huán)境因素的復(fù)雜相互作用，不同的PCR反應(yīng)體系進(jìn)入平臺(tái)期的時(shí)間和平臺(tái)期的高低都有很大變化，即使是重復(fù)實(shí)驗(yàn)，各種條件基本一致，后得到的DNA拷貝數(shù)也往往不同。因此經(jīng)過(guò)
定量PCR儀擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物量不能反映起始模板量的真實(shí)情況。通過(guò)傳統(tǒng)凝膠電泳EB染色或者同位素標(biāo)記只能定量PCR的終產(chǎn)物量，而不能定量起始DNA模版的拷貝數(shù)。
常用的定量PCR儀熒光標(biāo)記方法可簡(jiǎn)單分為兩大類(lèi)：
1.非特異檢測(cè)——雙鏈DNA內(nèi)插式熒光染料；
2.擴(kuò)增序列專(zhuān)一檢測(cè)——主要指熒光探針和引物探針。熒光染料技術(shù)成本低廉，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便；
而探針雜交技術(shù)在原理上嚴(yán)格，所得數(shù)據(jù)特異性高、更為。在選擇實(shí)驗(yàn)方案時(shí)要根據(jù)定量PCR儀實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?duì)數(shù)據(jù)精度的要求來(lái)決定。
非特異性檢測(cè)擴(kuò)增序列的代表是熒光染料。只與DNA雙鏈結(jié)合，插入DNA雙鏈時(shí)發(fā)出熒光；DNA雙鏈解鏈時(shí)釋放出來(lái)，熒光信號(hào)急劇減弱。在一個(gè)加入過(guò)量熒光染料的體系內(nèi)，其信號(hào)強(qiáng)度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。熒光染料法定量PCR的基本過(guò)程是：開(kāi)始反應(yīng)，當(dāng)染料與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光。DNA變性時(shí)，染料釋放出來(lái)，熒光急劇減少。在聚合延伸完成后，染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量定量PCR儀系統(tǒng)檢測(cè)到熒光的凈增量加大。I的大吸收波長(zhǎng)約為497nm，發(fā)射波長(zhǎng)大約為520nm。
定量PCR儀熒光染料的優(yōu)勢(shì)在于能監(jiān)測(cè)各種雙鏈DNA序列的擴(kuò)增，無(wú)需設(shè)計(jì)探針，檢測(cè)簡(jiǎn)單簡(jiǎn)便，成本低廉。然而正是由于熒光染料能和任何dsDNA結(jié)合，對(duì)DNA模板沒(méi)有選擇性，因此它也能與非特異的dsDNA（如引物二聚體）結(jié)合，使實(shí)驗(yàn)容易產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)，引物二聚體的問(wèn)題目前可以用帶有熔解曲線分析的軟件加以解決。要想用熒光染料法得到比較好的定量結(jié)果，對(duì)定量PCR儀引物設(shè)計(jì)的特異性和PCR反應(yīng)的質(zhì)量要求就比較高。
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