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熒光定量PCR儀PCR擴(kuò)增后的問題分析

更新時(shí)間:2017-08-23瀏覽:3139次
  熒光定量PCR儀廠家分析PCR擴(kuò)增各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件比較困難,例如GC含量偏高或偏低,導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物;在用作克隆目的的PCR因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對(duì)固定,引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次,盡量去滿足條件。
  PCR擴(kuò)增出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶:
  熒光定量PCR儀的PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致,或大或小,或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn),其原因:
  引物與靶序列不*互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體;
  Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān);
  酶的質(zhì)和量,往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn),酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。
  對(duì)策:必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物;減低酶量或調(diào)換另一來源的酶;降低引物量,適當(dāng)增加模板量,減少循環(huán)次數(shù);適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法。
  PCR擴(kuò)增出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶:
  PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差,dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有:減少酶量,或調(diào)換另一來源的酶;減少dNTP的濃度;適當(dāng)降低Mg2+濃度;增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。
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